Микросателлитная нестабильность при раке желудка

[12-147]
Определение микросателлитной нестабильности MMR (MSI)

27000 руб.

Микросателлитная нестабильность характеризует генетическую изменчивость многих опухолей. Определение данного показателя используется в процессе диагностики рака толстого кишечника, а также для назначения химиотерапевтического лечения.

Синонимы русские

Исследования при колоректальном раке.

Синонимы английские

Microsatellite instability, MSI; high level microsatellite instability, MSI-H; replication error phenotype, RER+.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь, образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Общая информация об исследовании

Гены, которые восстанавливают мутации в ДНК, известны как гены репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair, MMR). Существует четыре различных гена репарации, которые отвечают за исправление мутаций в ДНК. Если один из этих четырех генов мутирован, небольшие ошибки в ДНК остаются неисправленными. Эти ошибки приводят к расширению или уменьшению повторяющихся последовательностей в ДНК, что и называется микросателлитной нестабильностью (MSI).

Если человек рождается с мутацией в одном из четырех генов репарации (то есть мутация присутствует во всех клетках его тела), это приводит к синдрому Линча. Синдром Линча является наиболее распространенной наследственной формой рака толстой кишки, на его долю приходится 3 % всех случаев рака толстой кишки.

Тем не менее только небольшая часть опухолей с положительным результатом MSI обусловлена ​​синдромом Линча. Это означает, что большинство MSI-позитивных опухолей возникают спорадически и не обусловлены наследственной мутацией в гене репарации.

Для чего используется исследование?

Микросателлитная нестабильность чаще всего обнаруживается при раке толстого кишечника и является важным прогностическим показателем. Опухоли с высокой степенью MSI  не склонны к метастазированию, и их прогноз благоприятный.

Определение MSI проводят при скрининге пациентов, у которых подозревают синдром Линча – наследственный колоректальный рак, который часто сочетается с другими онкозаболеваниями: раком желудка, мочевыводящих путей, яичника, кожи, поджелудочной железы, опухолей головного мозга.

Выявление MSI высокой степени становится показанием для назначения таргетной терапии, то есть влияющей на конкретную генетическую мишень, которая стала причиной онкопроцесса. Этими препаратами являются ингибиторы рецептора PD-1, пембролизумаб и ниволумаб.

Также исследование микросателлитной нестабильности играет роль в определении потенциальной чувствительности опухолей к препаратам из группы 5-фторурацила, простым алкилирующим агентам и производным платины.

Когда назначается исследование?

1. Определение прогноза лечения рака толстого кишечника.
2. Определение эффективности химиопрепаратов.
3. Скрининг синдрома Линча.

Что означают результаты?

В результате исследования отмечается выявление или невыявление микросателлитной нестабильности.

Микросателлитную нестабильность (MSI) обнаруживают примерно в 15 % от всех раков толстого кишечника. Причем частота выявления MSI при колоректальном раке зависит от стадии заболевания, составляя до 22 % при II стадии, до 12 % при III стадии и не более 3-4 % при IV стадии.

Если колоректальный рак или другие опухоли связаны с синдромом Линча, то в 90 % случаев будет обнаружена микросателлитная нестабильность.

Высокий уровень микросателлитной нестабильности MSI означает:

• данная опухоль не склонна к образованию метастазов и пациентам со II стадией заболевания можно не проводить адъювантную химиотерапию;

• у пациента высока вероятность наличия синдрома Линча;

• пациенту показано назначение таргетной химиотерапии (ингибиторы рецептора PD-1, пембролизумаб и ниволумаб).



Кто назначает исследование?

Онколог.

Безусловно, молекулярно-биологический механизм формирования опухоли в теле человека еще не изучен во всех деталях. Однако современные данные позволяют с уверенностью утверждать: многие моменты онкогенеза помогает прояснить явление микросателлитной нестабильности. Данный материал о том, что представляет из себя этот процесс, и как он связан с развитием опухоли.

Микросателлиты — это короткие последовательности в структуре ДНК, состоящие из 2–9 пар нуклеотидов. Они располагаются в эухроматиновой части генома, чаще — в некодирующих, регуляторных его участках. На сегодняшний день изучение последовательностей микросателлитов имеет массу вариантов практического применения. Так, длину микросателлитных участков и количество повторов в их структуре изучают в контексте диагностики некоторых наследственных заболеваний. К ним относятся атаксия Фридриха, миотонические дистрофии и другие неврологические патологии. При помощи исследования микросателлитных последовательностей проводится генотипическое картирование, необходимое для расшифровки генома. Нашли применение микросателлиты и в диагностике наследственных опухолевых синдромов и спорадических случаев рака.

Понятие микросателлитной нестабильности отражает изменения в геноме, связанные со структурой микросателлитов. Выделяют несколько вариантов такой нестабильности. Например, вариант EMAST подразумевает повышение частоты альтерации микросателлитов, состоящих из повторов четырех нуклеотидов. В случае различных спорадических опухолей человека микросателлиты демонстрируют тенденцию к значительному увеличению их числа, более частому мутационному повреждению, возникновению делеций и инсерций (точечных мутаций, связанных с выпадением или вставкой нуклеотидов соответственно) [1]

Рисунок 1 | Основные виды точечных мутаций в геноме человека.

Наиболее тесным образом микросателлитная нестабильность связана с нарушениями в системе репарации ДНК, а именно — с вариантом mismatch-репарации. Этот процесс как вариант репарации неспаренных оснований в структуре ДНК способствует исправлению тысяч мутаций, возникающих в геноме каждого человека ежедневно. Систему mismatch-репарации составляют шесть генов, продукты которых ответственны за обнаружение неспаренных участков — пар нуклеотидов, созданных не по принципу комплементарности. После выявления таких участков продукты системы mismatch-репарации производят удаление определенного участка цепи, включающего неспаренные нуклеотиды, и замену вырезанных участков новыми в правильной последовательности.

Рисунок 2 | Упрощенный принцип работы системы mismatch-репарации.

Наследственные дефекты любого гена системы mismatch-репарации приводят к развитию наследственных опухолевых синдромов — например, синдрома Линча (о нем мы писали в этом материале). Приобретенные в течение жизни мутации в этих же генах могут приводить к формированию дефицита их продуктов. Дефицит компонентов системы mismatch-репарации условно ведет к сохранению множества неисправленных мутаций в генах соматических клеток (условно, поскольку помимо системы mismatch функционируют и другие репаративные системы). Однако уже доказанным является тот факт, что в конечном итоге наличие дефекта системы mismatch-репарации может приводить к формированию злокачественного новообразования, в основном колоректальной локализации [2].

Дефекты системы репарации ДНК отражаются в том числе и в увеличении числа микросателлитов генома — так формируется H-фенотип (high phenotype) микросателлитной нестабильности, обозначаемый как MSI-H. Данный фенотип является определенного рода маркером злокачественных новообразований, а именно — маркером наличия дефекта в системе репарации генома.

Интерес для современных ученых представляет и другой фенотип микросателлитной нестабильности, обозначаемый буквой L (low). Он отражает, напротив, снижение количества микросателлитных последовательностей в геноме, что встречается при наследственном неполипозном раке прямой кишки в ранних ее формах. Патогенез снижения уровня микросателлитов при наличии такой опухоли неясен, однако оно также может являться маркером, используемым при выявлении данного типа новообразований [3].

Классическим способом диагностики любой из форм микросателлитной нестабильности является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Амплификация микросателлитных последовательностей позволяет установить их количество и структуру, и таким образом косвенно судить о дефиците компонентов системы репарации и отобразить фенотип нестабильности. Заключением такого анализа является либо выявление факта микросателлитной нестабильности с указанием фенотипического варианта, либо MSS — то есть стабильность микросателлитных участков генома.

Определенное значение имеет и выявление тканевого уровня самих белков-компонентов системы mismatch-репарации методом иммуногистохимии. В этом случае препараты исследуемой ткани обрабатываются специальными растворами, позволяющими по степени яркости окрашивания установить уровень того или иного белка и принцип его клеточного распределения. Метод иммуногистохимии позволяет точнее определить характер дефекта и используется, как правило, после проведения автоматизированного анализа методом ПЦР для определения наличия и характера микросателлитной нестабильности. Кроме того, перед проведением исследования необходимо удостовериться в наличии положительной корреляции между частотой возникновения дефицита системы mismatch-репарации и развитием исследуемой опухоли, так как в случае некоторых онкопатологий (например, при раке тела матки) ИГХ-исследование таких дефектов неэффективно [4].

Новости онкологии

02.04.2018

На вопросы редакции Газеты RUSSCO отвечает
ТРЯКИН Алексей Александрович,
доктор медицинских наук, главный научный сотрудник
отделения клинической фармакологии и химиотерапии
ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России,
национальный представитель России в ESMO.

– Микросателлитной нестабильности в настоящее время уделяется большое внимание в практической онкологии. Что такое микросателлитная нестабильность?

– У млекопитающих существует сложная система, исправляющая нарушения в ДНК, которые возникают достаточно часто. Одним из таких механизмов является система репарации неспаренных оснований ДНК (mismatch repair system – MMR), которая ответственна за распознавание и удаление неправильно спаренных оснований, образованных в результате ошибок в процессе репликации ДНК. За работу системы репарации неспаренных оснований ДНК отвечают 6 генов: MSH2, MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 и MLH3. Наличие герминальных мутаций в этих генах приводит к развитию синдрома Линча. Чаще встречается другой, ненаследственный механизм формирования дефицита MMR (dMMR), в подавляющем большинстве случаев заключающийся в метилировании промотера MLH1 в самой опухоли. В результате dMMR появляется большое число мутаций со сдвигом рамки считывания, что приводит к формированию стоп-кодонов и синтезу нефункциональных белков.

Микросателлиты представляют собой короткие последовательности в ДНК из 1-5 оснований, повторяющиеся до нескольких десятков раз. Микросателлиты встречаются и в норме, однако при dMMR их число увеличивается, что и может быть выявлено. Таким образом, понятия dMMR и микросателлитная нестабильность (MSI) описывают один и тот же процесс и в подавляющем большинстве случаев являются тождественными.

– Какими методами определяется микросателлитная нестабильность?

– Классическими методом определения MSI является ПЦР, которая амплифицирует микросателлитные повторы в ДНК, и путем сравнения их длины между опухолевыми и нормальными клетками определяется уровень нестабильности генома. Чаще применяется модель из 5 маркеров на мононуклеотидные (BAT26, BAT25) и двунуклеотидные последовательности (D2S123, D5S346, D17S250). Посредством сравнения с нормальной тканью (чаще кровью) выделяются 3 варианта MSI: MSI-Н (высокий уровень MSI), когда ≥2 маркеров нестабильны, MSI-L (низкий уровень MSI), когда нестабилен 1 маркер, и MSS (стабильный уровень), когда стабильны все маркеры. Значение низкого уровня MSI до сих пор четко не установлено, и этих пациентов расценивают как больных с MSS опухолями.

Вторым вариантом диагностики dMMR является иммуногистохимическое исследование (ИГХ), когда в опухоли изучается экспрессия белков MSH2, MLH1, PMS2, MSH6. В случае отсутствия окрашивания хотя бы одного белка устанавливается дефицит MMR.

Обе методики демонстрируют высокую (>95%) конкордантность и являются в сложных случаях взаимодополняющими, так как существуют редкие варианты нарушения MMR, диагностируемые только ПЦР или только ИГХ. В последние годы появилась возможность определять MSI помощью секвенирования следующего поколения (NGS), когда при секвенировании сотней генов удается выявлять и микросателлитные повторы, при этом не требуется в качестве образца нормальная ткань пациента. Однако данные панели являются пока еще достаточно дорогостоящими и мало распространены в России.

– Для чего определяется микросателлитная нестабильность?

– Определение микросателлитной нестабильности становится все более востребованным тестом при ряде опухолей – прежде всего, при колоректальном раке (КРР), раке эндометрия, раке желудка и тонкой кишки. Во-первых, определение MSI является скрининговым тестом для диагностики синдрома Линча. Это важно не только для самого пациента, но и для членов его семьи. Несмотря на наличие клинических критериев (Амстердамские критерии), позволяющих заподозрить синдром Линча, у 40-50% пациентов с данным заболеванием они отсутствуют. Во-вторых, опухоли с MSI имеют ряд особенностей, позволяющих дифференцированно подходить к их лечению. Так, при II стадии КРР наличие MSI свидетельствует о благоприятном прогнозе и в большинстве случаев о возможности отказа от проведения адъювантной химиотерапии. У пациентов с MSI малоэффективна адъювантная химиотерапия монотерапией фторпиримидинами, что требует обязательного применения режимов с включением оксалиплатина (XELOX или FOLFOX). В то же время у пациентов с IV стадией наличие MSI является неблагоприятным прогностическим признаком, что может быть связано с наличием мутации в гене BRAF у каждого третьего пациента. В-третьих, недавно было показано, что опухоли с MSI обладают уникальной чувствительностью к иммунотерапии ингибиторами контрольных точек.

– Какова примерная стоимость теста на микросателлитную нестабильность?

– Стоимость теста на MSI в Москве составляет около 6000-8000 руб.

– Колоректальный рак был одной из первых опухолей, для которой была подтверждена роль микросателлитной нестабильности и эффективность ингибиторов контрольных точек. С какой частотой определяется микросателлитная нестабильность у этих больных?

– Частота выявления MSI при КРР варьирует от стадии заболевания, составляя до 22% при II стадии, до 12% – при III стадии и не более 3-4% – при IV стадии. В большинстве случаев это спорадические нарушения, частота синдрома Линча даже при II стадии составляет лишь около 3%.

– Какова эффективность ингибиторов контрольных точек у больных колоректальным раком с микросателлитной нестабильностью?

– Ингибиторы контрольных точек (прежде всего, анти-PD1 антитела) первоначально изучались на классических иммунотерапевтических опухолях – меланоме, раке почки. У пациентов с КРР ингибиторы контрольных точек оказались малоэффективны, однако в отдельных случаях были отмечены выразительные и длительные эффекты. При дополнительном анализе оказалось, что у этих пациентов были опухоли с высокой MSI.

Как показали последующие исследования у больных с MSI, монотерапия пембролизумабом и ниволумабом позволяет достичь объективного ответа у 30-50% больных, а в течение 12 месяцев без признаков прогрессирования остаются 34-50% пациентов. При этом следует помнить, что до половины пациентов к моменту включения в эти исследования уже получили не менее трех линий терапии. Важно, что ингибиторы контрольных точек были эффективны у больных вне зависимости от мутации BRAF, наличия синдрома Линча, экспрессии PD-L1.

– Почему терапия ингибиторами контрольных точек в общей популяции больных метастатическим колоректальным раком не оказалась пока столь же эффективной, как у других пациентов, например, с меланомой, раком легкого, опухолями головы и шеи и т.п.?

– На сегодняшний день иммуноонкология находится еще в начале своего пути. До сих пор отсутствуют четкие предикторы эффективности терапии ингибиторами контрольных точек. Вероятнее всего, впечатляющая эффективность данной группы препаратов при опухолях с MSI обусловлена высокой частотой мутаций, в десятки и сотни раз превышающих «обычные» опухоли с MSS фенотипом. Большая частота мутаций приводит к формированию и большего числа опухолевых неоантигенов, являющихся мишенью для Т-лимфоцитов.

– Знаете ли Вы случаи применения ингибиторов контрольных точек при микросателлитной нестабильности в России?

– Насколько я знаю, опыт применения ингибиторов контрольных точек при микросателлитной нестабильности в России ограничивается участием в упоминавшихся выше исследованиях и отдельными пациентами, которые приобретали препараты самостоятельно. К сожалению, данное показание еще не зарегистрировано в России, что практически полностью исключает возможность бесплатного обеспечения больных препаратами данной группы.

– При планировании лечения больных метастатическим колоректальным раком на какое место Вы бы поставили оценку микросателлитной нестабильности с последующим назначением ингибиторов контрольных точек?

– Мы пока не знаем о роли ингибиторов контрольных точек при резектабельных опухолях. Допускаю, что они окажутся эффективными в качестве адъювантной терапии при III стадии у пациентов с MSI. Исходя из высокой эффективности и благоприятного профиля токсичности, я бы рекомендовал назначение этих препаратов пациентам с прогрессированием уже после первой линии терапии, либо в первой линии, если пациент не кандидат для активной химиотерапии.

– Были ли прямые исследования, которые сравнивают терапию ингибиторами контрольных точек и анти-EGFR антителами у больных с микросателлитной нестабильностью и диким типом RAS?

– Прямые сравнения этих групп препаратов не проводились. Следует помнить, что у 30-40% больных с MSI имеется мутация BRAF, которая предполагает резистентность к анти-EGFR антителам. У пациентов с «тройным диким типом» (KRAS, NRAS, BRAF) эффективность химиотерапии и анти-EGFR антител, вероятнее всего, примерно соответствует общей популяции пациентов с MSS.

– Как Вы считаете, есть ли будущее иммуноонкологии у больных колоректальным раком?

– Иммунотерапия больных КРР с MSI не ограничивается монотерапией анти-PD антител. В недавно опубликованном исследовании Сheckmate 142 совместное применение ниволумаба и ипилимумаба у пациентов с MSI показало еще более впечатляющие результаты: частота объективного ответа составила 55%, а 71% пациентов были без прогрессирования на протяжении 12 месяцев терапии.

Не прекращаются попытки применения иммунотерапии у пациентов с MSS фенотипом. Так, на ASCO GI 2018 были представлены результаты совместного применения атезолизумаба (анти-PD-L1 антитело) и кобиметиниба (анти-MEK1/2 ингибитор). Как было показано ранее, последний способен усиливать иммунный ответ посредством усиления иммунного распознавания, аккумуляции Т-лимфоцитов в опухоли и снижения их истощения. Несмотря на то, что 94% больных получили 3 и более линии терапии, удалось достичь объективного ответа и контроля болезни у 8% и 31% пациентов соответственно.

Хочется надеяться, что в недалеком будущем мы увидим результаты других позитивных исследований, посвященных иммунотерапии КРР.

– Спасибо.

Узнать больше о лечении колоректального рака можно на
конференции RUSSCO «Опухоли ЖКТ – Колоректальный рак»
(13-14 апреля 2018, Москва, Марриотт Москва Гранд Отель, Тверская ул., 26/1)